Antibiorésistance des Entérobactéries Productrices de β-lactamases à Spectre Etendu isolées de l’Hôpital de Sétif : Détermination des Gènes par PCR-Multiplex

Ce mémoire évalue la résistance aux antibiotiques des entérobactéries isolées à l’Hôpital de Sétif, en se concentrant sur les β-lactamases à spectre étendu (BLSE) et leur caractérisation génétique par PCR-Multiplex. Les résultats montrent une prévalence élevée de résistance aux β-lactamines, avec une dominance des gènes CTX-M.

Université Ferhat Abbas Sétif
Faculté des sciences de la nature et de la vie
Département de microbiologie
Master en biologie
Filière: Biologie
Spécialité: Microbiologie appliquée
Mémoire
Antibiorésistance des entérobactéries productrices de β-lactamases à spectre étendu isolées de l’Hôpital de Sétif : détermination des gènes par PCR-Multiplex

Refoufi Khalil Abdallah
Dirigé par: Dr. Silini-Cherif Hasfa & Pr. Sahli Farida
2016/2017
Sommaire
Listes de tableaux
Listes des figures
Liste des abréviations
Résumé
Introduction 1
Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

Les entérobactéries 3

Définition 3
Classification 3
Caractères bactériologiques 3
Caractères biochimiques 4
Caractères antigéniques 4
Pouvoir pathogène 4

Les β-lactamines 7

Classification des β-lactamines 7

Les pénicillines (noyau péname) 8
Les céphalosporines (noyau céphème) 8
Les pénèmes (carbapénèmes) 10
Les monobactames 10
Les inhibiteurs des β-lactamases 10

Mode d’action des β-lactamines 12

Résistance des entérobactéries aux β-lactamines 12

Types de résistance 12

La résistance naturelle 13
La résistance acquise 13

Supports génétiques de la résistance 14

Le chromosome 14
Les éléments génétiques mobiles 14

Plasmides 15
Séquences d’insertion et transposons 16
Les intégrons 16

Mécanismes de résistance aux β-lactamines 17

Diminution de la perméabilité 17
Modification de la cible 17
Hyperproduction du système d’efflux 17
Production d’enzymes 18

Les β-lactamases 18

Classification des β-lactamases 19

Classification d’Ambler 19
Classification de Bush-Jacoby-Medeiros 20

Les β-lactamases à spectre élargi BLSE 22

Différents types de BLSE 22

BLSE de type TEM (Temoneira – nom du patient) 22
BLSE de type SHV : (Sulfhydryl variable) 24
BLSE de type CTX-M (Cefotaximase-Munich) 25
Autres types de BLSE 25
Les carbapénèmases 26

Épidémiologie mondiale des entérobactéries BLSE 29

Les BLSE classiques 29

En Europe 29
En Afrique 29
En Asie 30
En Amérique 31

Les BLSE de type carbapénèmases 32

Facteurs de risque d’acquérir une BLSE 33

Chapitre 2 : Matériel et méthodes

Prélèvement et identification 34

La mini galerie (galerie classique) 34
La galerie Api 20E 35
Le système MicroScan WalkAways SIEMENS 35

Antibiogramme 36
Détection phénotypique des EBLSE 37

Test de synergie 38
Test du double disque 38
Test à la cloxacilline 39

Détection génotypique des EBLSE 40

Extraction d’ADN plasmidique par la lyse alcaline 40

Extraction d’ADN 40
Extraction de l’ADN chromosomique par boiling 41

Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) 41

Principe 41

Électrophorèse sur gel d’agarose 43

Chapitre 3 : Résultats et discussion
Résultats 44

DEDICACE
Je dédie ce modeste travail à celle qui m’a donné la vie le symbole de tendresse qui s’est sacrifiée pour mon bonheur et ma réussite, à la lumière de ma vie أمي
A ma cher grand mère Malika
A mes frères Mohsen et Ayoub que J’aime beaucoup A mes sœurs Hadjer et Hafsa que j’aime autant
A ma cher époue Aicha qui m’a aidé tout ce parcours de Master A mes deux petites puces Ritedj et Djenat
A mes oncles TOUFIK, SEDDIK, LAZHER, AZZEDINE, AHMES et FETHEDDINE A mes tentes NABILA, HOURIA, SAMIA, KHAOULA, LAMIA, et HANANE
A tout mes cousins et cousines
A mes meilleurs amis KAMAL et FOUZI
A Moumeni A/Krim et Zerroug Imad qui mon soutenue A Radjai Issam prof. d’Anglais qui ma beaucoup aidé
A mes collégues de ces deux années de Master surtout Kebaili Oussama, Boutaghane, Méziane Amine, Marouani Kaouther et Soltani Nassima qui mon aidés a intégré
A ma famille REFOUFI et GHODBANE
REMERCIEMENT
Avant tout, je remercie le bon Dieu tout puissant qui m’a donné la force et de m’avoir permis d’arriver à ce stade-là.
Ce travail a été effectué au sein de deux laboratoires : Laboratoire de « Microbiologie »,
Hôpital « SAADNA Mohamed Abdennour » de Sétif, Algérie ; et Laboratoire de recherche à l’Université FERHAT Abbas, Faculté des Sciences Nature et Vie, El BAZ.
Mes remerciements s’adressent d’abord, à mon directeur de thèse, le Docteur SILINI-CHERIF Hafsa. Je la remercie pour son encadrement, pour ses encouragements et sa rigueur scientifique au quotidien durant ce modeste travail. Merci de m’avoir fait confiance et m’a encouragé pour la réalisation de mon mémoire de fin d’étude.
Je remercie également, ma co-directrice de thèse, Madame le Professeur SAHLI Farida pour ses aides et ses orientations.
C’est avec un grand plaisir que je remercie le Docteur SILINI Allaoua, pour l’honneur qu’il m’a fait en acceptant de présider le jury de cette thèse, que ce travail constitue le témoignage de notre respect.
Je tiens également à exprimer mes plus profonds remerciements au Docteur YAHIAOUI Bilal, pour sa disponibilité, et pour l’honneur qu’il m’a fait en acceptant d’examiner ce travail. Je le remercie pour ses précieux conseils et ses encouragements.
Je remercie le Docteur MESSAI Chafik Redha pour l’aide et les conseils qu’il ma donné. Je voudrais désormais remercier Mr BIAZ Mustapha, le chef de service du laboratoire de
Microbiologie, CHU de Sétif ; pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire, pour ses discussions scientifiques et son ouverture d’esprit. Je le remercie pour sa confiance, son soutien, ses encouragements, et son affection.
Mes vifs remerciements s’adressent également a Mme YAHIA-CHERIF-BOUNECHADA Nora de m’avoir aidé tout au long de ma présence au Laboratoire de Sétif.
Je souhaite remercie aussi toute l’équipe du Laboratoire surtout HARBOUCHE Wided, KHABCHACHE Hasna, BOULAHYA Zineb, GUETTOUCHE Houda, AYADI Hayet, DIABI
Nardjes, BOUDJLLEL Naziha, CHERRAD Hasna, Marwa. Je remercie aussi tous mes collègues et mes enseignants, ainsi que les personnels administratifs de l’université FERHAT Abbas.
Merci enfin à l’ensemble des personnes qui m’ont aidé de prés ou de loin dans l’élaboration de ma thèse.
Liste des tableaux
Tableau 1. Classification des β-lactamines 11
Tableau 2. Classification global des BLSE 21
Tableau 3. Principales carbapénémases des entérobactéries 27
Tableau 4. Antibiotiques testés 37
Tableau 5. Composition des différents tampons d’extraction 40
Tableau 6. Amorces utilisées 41
Tableau 7. Etapes de la PCR-Multiplex 42
Tableau 8. Différents types de plasmides extraits des EBLSE 56
Tableau 9. Caractéristiques générales et moléculaires des souches d’entérobactéries productrices de β-lactamases à spectre étendu isolées au CHU de Sétif 61-62
Liste des figures
Figure 1. Structures chimiques des principales β-lactamines et inhibiteurs de β-lactamases… . 8
Figure 2. Structure chimique de la ceftaroline 10
Figure 3. Modes de transmission du matériel génétique : la conjugaison, la transformation et
la transduction chez les bactéries 15
Figure 4. Mode d’action des β-lactamases 18
Figure 5. Les BLSE dérivées de TEM 23
Figure 6. Les BLSE dérivées de SHV 24
Figure 7. Disposition des disques d’antibiotique pour le test de synergie 38
Figure 8. Schéma de détection de BLSE par le test du double disque 39
Figure 9. Photo du thermocycleur TC-4000 42
Figure 10. Photo d’une migration d’ADN par électrophorèse 43
Figure 11. Photo du transilluminateur Fisher-Bioblock UV 43
Figure 12. Répartition des entérobactéries selon l’espèce 44
Figure 13. Pourcentages des entérobactéries selon l’origine de l’infection 45
Figure 14. Pourcentages des souches entériques selon le sexe 46
Figure 15. Répartition des entérobactéries selon les tranches d’âge 46
Figure 16. Pourcentages de résistance des entérobactéries aux antibiotiques 47
Figure 17. Pourcentages de résistance des entérobactéries aux β-lactamines par année 48
Figure 18. Pourcentages de résistance des entérobactéries aux autres antibotiques par année 49
Figure 19. Fréquence des EBLSE 49
Figure 20. Répartition des EBLSE par espèce 50
Figure 21. Répartition des EBLSE selon l’origine de l’infection 51
Figure 22. Répartition des EBLSE selon le service 51
Figure 23. Répartition des EBLSE selon la nature du prélèvement 52
Figure 24. Répartition des EBLSE selon le sexe 52
Figure 25. Test de synergie 53
Figure 26. Test de synergie vu dans un antibiogramme d’une souche Klebsiella pneumoniae
BLSE+ 54
Figure 27. Profil de résistance des EBLSE aux antibiotiques 55
Figure 28. Profil plasmidique des 56 souches d’EBLSE 57
Figure 29. Amplifications par PCR-Multiplex des gènes blaCTX-M, blaSHV et blaTEM 59
Figure 30. Prévalence des gènes de résistance chez les souches amplifiées 60
Figure 31. Stratégies et les cibles bactériennes utilisées pour lutter contre la résistance aux. 71
Liste des abréviations:
ATB : Antibiogramme. BCP : Bromo-Créso-Phénol. bla : bêta-lactamse.
BLSE : β-Lactamase à Spectre Elargi.
C1/2/3/4/5G : Céphalosporine de 1ére /2éme /3éme /4éme /5éme Génération.
Cfr : Citrobacter freundii.
CHU : Centre Hospitalo-Universitaire. CMI : Concentration Minimale Inhibitrice. CTX-M : Céfotaximase-Munich.
DAEC : E. coli à Adhérence Diffuse.
Eae : Enterobacter aerogenes.
EAEC : E. coli Entéroagrégatives.
EBLSE : Entérobactéries β-Lactamase à Spectre Elargi.
Ecl: Enterobacter cloacae.
Eco: Escherichia coli.
EHEC : E. coli Entérohémorragiques.
EIEC : E. coli Entéroinvasives.
Enz : Enzyme.
EPEC : E. coli Entéropathogènes.
ETEC : E. coli Entérotoxinogènes.
IR : Intégrons de Résistance.
kpb : kilos paire de base.
KPC : Klebsiella pneumoniae Carbapénémase.
Kpn: Klebsiella pneumoniae.
KT : cathéter.
LCR : Liquide Céphalo-Rachidien.
LP : Liquide Pleural.
McF : McFarland.
MH: Muler-Hinton.
Mmo: Morganella morganii
MYSTIC: Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection.
MβL : Métallo-β-Lactamase.
OMS : Organisation Mondiale de la Santé.
ONPG : OrthoNitrophényl b-D-GalactoPyranoside.
pb : paire de base.
PB : Prélèvement Buccal.
PBP: Penicillin Binding Proteins.
PCR: Polymerase Chain Reaction.
PLP : Protéines de Liaison aux Pénicillines.
PR : Prélèvement Rectal.
PV : Prélèvement Vaginal.
RM : Rouge Méthyle.
Ser : Sérine.
SHV: Sulfhydryl Variable. SI : Séquence d’Insertion. Sma : Serratia marcescens. TEM: Temoneira.
TRI : TEM Résistantes aux Inhibiteurs.
TSI : Triple Sugar Iron.
VP : Voges-Proskauer.
WHO: World Health Organization.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE
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ANNEXE
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Figure 34. La plaque utilisée par l’automate pour l’identification et l’antibiogramme.
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• Figure 35. L’automate MicroScan WalkAways.